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    生物樣本透射電鏡（TEM）

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    生物樣本透射電鏡（TEM）

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    項目介紹

    生物透射電鏡介紹：透射電鏡，即透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，簡稱 TEM），是一種最高分辨率可達到0.1-0.2納米的顯微鏡，是觀察和研究超微結構的重要工具。在生物科學研究方面，透射電鏡可用來觀察細胞整體結構、細胞亞細胞結構，包括（植物）細胞壁、細胞膜、細胞核和各種細胞器的變化、外源物質（如病原微生物、各種納米顆粒）與細胞的關系，如外源物質進入細胞內部的方式、在細胞內的分布情況、細胞對外界刺激的反應（包括自噬、凋亡、壞死等）。

    1. 主要用于生物樣品（細胞，生物組織）材料內部形貌的分析和研究；

    2. 對樣品進行包埋，超薄切片，染色等工序，制成TEM樣品；

    3. 通過透射電鏡觀察樣品內部的組織形貌。

    預約前請務必閱讀

    前處理方法：

    您需要提供的樣品：收集細胞/組織取樣（新鮮迅速取材），置于1.5ml尖底離心管內，加入預冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛固定液（固定液加到?離心管，使樣品完全浸沒在固定液中），放置于4℃過夜，請不要倒棄固定液，一般固定12h或過夜后可寄送。

    具體取材及固定方法如下：

    1.對于細胞類，106以上的細胞，用新鮮的培養液興奮細胞，用細胞刮刀刮下來或者酶消化，加入預冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液，固定半小時，1500-3000轉離心，5-10min，收集細胞于管底肉眼可見黃豆或者綠豆粒大小，棄上清，沿管壁緩慢加入4℃新的固定液，然后放入4°C冰箱過夜。

    2.對于組織類，新鮮取材，取材位置準確，組織大小盡量在1-2mm3（長1-5mm×寬1mm×高1mm），離體取材后請盡快投入4℃預冷的固定液中，然后放入4°C冰箱固定過夜。

    3.對于細菌類，吸取OD0.5-0.8的培養物，加入預冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液，固定半小時，3000-5000轉離心，5-10min，離心后棄上清，收集菌體沉淀于管底黃豆大小，可以用預冷的pH7.2的PB洗1-2次，棄上清，沿管壁緩慢加入新的4℃預冷的固定液，然后放入4°C冰箱過夜。

    樣本編號建議按照字母或數字來，標記清晰，樣本量充足。

    *固定液的量請參考上圖，加至箭頭所示位置，細胞、細菌、真菌樣品用尖底離心管

    *如為其他特殊樣品，需要特殊的固定方式和前處理方式，請與工作人員溝通確認。

    樣品要求

    1. 樣品需要用戊二醛固定，一般固定2小時即可冰袋運輸（特殊樣品需要固定時間長一些），戊二醛的量要多，樣品管保留一定量的空氣。

    2. EP管用封口膜封好（防止管口漏液），EP管外用泡沫包好，避免低溫冰凍造成樣品結冰。

    3. 樣品中固體含量至少一顆芝麻粒大小，細胞和菌類要米粒大小；生物新鮮組織樣品取材到相應濃度的戊二醛固定液里，不益超過1min，以便較少自融，戊二醛需要預冷4-10℃再使用；

    4. 一般送樣方式為4℃冰袋冷藏運輸，冷凍送樣需要在訂單中特別指明。

    5. 該項目不支持回收，請自行留樣。

    6. 可測試細菌、細胞、生物組織等樣品。

    7.請盡量注明圖片標尺或具體需要拍攝的內容，可輸出10um、5um、2um、1um、500nm、200nm和100nm的標尺；如未注明,實驗室不接受因標尺問題導致的免費補拍或重拍。

    項目案例

    TEM觀察納米顆粒在細胞內具體的結合位點

    銹菌的TEM圖

    動物組織的TEM圖

    某細菌的TEM圖

    常見問題
    1、為什么通過光鏡（免疫熒光等）和分子實驗（ELISA/WB等）觀察到自噬、凋亡等現象，摸索出信號最強的時間點取材，結果電鏡下細胞不是結構爛就是沒有期待的結構呢？可能的原因有哪些？

    答：光鏡和分子水平的變化與超微結構變化不完全平行！是基本上從來都不準確同步的，所以已經做了其他實驗后想來看自噬和凋亡的，不一定能看到，鐵死亡、外泌體等都有這個問題。

    可能的原因有：

    1.光鏡分辨率不夠，看上去陽性的東西，可能根本不在預期結構上。比如，線粒體相關的某標記物，光鏡下看到胞質里陽性顆粒很多了，結果電鏡下完全沒有。精細實驗后發現標記的其實是某些溶酶體。

     2.生理或病理過程本身的原因。比如有老師來看凋亡，給了熒光照片，胞核標記物超級清楚，結果電鏡下細胞很爛。也有給了WB結果，選的陽性最強的時段取材，結果電鏡下細胞完好。他們都是同一板細胞分取的。可能分子結果反映的是表達沒有，表達了不見得正在發揮作用，形態還是好的。熒光都看到了，那細胞崩裂已經開始，鏡下就好不了。

    2、動物普通組織取材、送樣

    取材原則：切薄并盡快投入固定液；注意下述要求。

    1. 請盡快固定。動物組織最好在離體后1 min內開始固定。

    2. 非灌注的組織，厚度不超過4 mm，請用恰當方式（比如切寬薄片）體現位置和層次關系。盡量不要事先切成很小的顆粒。

    3. 請用鋒利薄刀片切組織，朝一個方向劃，不要來回切割，不要擠壓、拉扯。

    4. 含有食物殘渣（如消化道）、大量血液（如心肌）或其它黏附物（如乳腺等）的組織，請用生理鹽水快速漂洗，再投入固定液。

    5. 請保證固定液量充足。固定液和組織的體積比不小于20 : 1。

    6. 最初的30 min以后，最好在4 ℃的固定液中浸泡，嚴禁結冰（太靠近冰箱后壁或冰袋運輸都可能使組織結冰。冬季寧可常溫送樣）。

    備注：

    （1）組織尺寸和容器關系（只裝一個的參考標準）：

    芝麻到綠豆大小（如小鼠腎上腺）：請用1.5 ml EP管；

    黃豆大小（小鼠腎臟）：請用5 ml離心管；

    鋪展面積類似蠶豆大小的組織片：請用平底的25 ml廣口瓶；

    （2）每個容器含有N個組織時：容器體積要適當增大，組織不要相互擠壓變形。

    3、培養細胞常規簡易取材、送樣？

    1. 最好刮取細胞，收集在離心管中，1500 rpm離心5 ~ 10 min（該參數可按自己的經驗調整，目的是不損傷細胞結構的情況下去掉培養液成分）。

    2. 棄上清，加入固定液重懸細胞。

    3. 細胞懸液盡快（1分鐘內，久了離心難以緊固）轉移至1.5 ml尖底EP管，立即以10000 r/min離心12 min（該參數適用于一般小型臺式離心機，不可隨意更改，務必使細胞離緊不散）；離緊后的細胞約半顆綠豆大小，切不可太大。

    4. 靜置15 min，然后小心棄上清，再沿管壁緩慢加入室溫或4 ℃固定液（不可沖擊、吹散細胞）。

    5. 在4 ℃保存或運輸。嚴禁結冰（太靠近冰箱后壁或冰袋運輸都可能使組織結冰。冬季寧可常溫送樣）。

    備注：

    （1）對細胞表面結構沒有特殊觀察要求的動物細胞，均可按本法操作，比如精子、血液、脫落細胞等。薄壁細菌也可按本法處理。

    （2）觀察細胞連接的實驗，嚴禁用消化的方法收集細胞。

    （3）不耐受高速離心的樣品，請以懸液送樣。盡可能裝滿，以減少運輸途中的震蕩。

    （4）厚壁真菌等離心緊固后不易滲透的樣品，也請以懸液送樣，要求同上。

    4、固定液類型及介紹？

    大多數動物組織和培養細胞，提供2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。專門觀察神經髓鞘的，提供3%戊二醛＋Plus輔劑（臨用前5 min內混合）；觀察厚壁真菌或細菌芽孢等，提供K-T固定液。具體根據樣本類型選擇合適的固定液，并非完全統一。

    生物樣本透射電鏡（TEM）

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